Лаборатория химии пептидов 


Основные научные направления
Основные результаты
Гранты

Руководитель подразделения:

Козловская.jpg

КОЗЛОВСКАЯ Эмма Павловна
доктор химических наук,
и.о. заместителя директора Института по научным вопросам

Научные сотрудники:

Гладких.jpgМонастырная.jpgЗелепуга.jpg
ГЛАДКИХ
Ирина Николаевна,
к.х.н., н.с.
irinagladkikh@gmail.com
МОНАСТЫРНАЯ
Маргарита Михайловна,
д.х.н., в.н.с.
rita1950@mail.ru
ЗЕЛЕПУГА
Елена Александровна,
к.ф.-м.н., н.с.
zel@piboc.dvo.ru
Табакмахер.jpgЛейченко.jpgЛогвинов.jpg
ТАБАКМАХЕР
Валентин Михайлович,
аспирант
tabval@piboc.dvo.ru
ЛЕЙЧЕНКО
Елена Владимировна,
к.х.н., с.н.с
leychenko@piboc.dvo.ru
  ЛОГВИНОВ  
Степан Викторович,  
лаборант  
logvinov@piboc.dvo.ru 

Основные научные направления:
  • Структура и функция биологических макромолекул (белки).
  • Использование микроорганизмов в биотехнологии.
  • Расчетные методы исследования структурно-функциональных взаимосвязей.
  • Конструирование ферментных лекарственных препаратов пролонгированного действия.

Основные результаты:

Из нескольких видов актиний выделено и охарактеризовано более 40 индивидуальных соединений белковой природы. Разработано несколько оригинальных схем выделения и очистки полипептидов, подтвержденных патентами РФ.

Методами структурной белковой химии установлены полные аминокислотные последовательности нейротоксинов RTX-IV из тропической актинии Heteractis сrispa. Было показано, что Heteractis токсины принадлежат к новому структурному типу 2 так называемых длинных анемонотоксинов. Tоксины 1-го типа (главным образом, представители семейства Actiniidae) и 2-го типа (семейтво Stichodactylidae) содержат 46–49 а.о., имеют три дисульфидных мостика, локализация которых впервые определена для RTX-III. Для вторичной структуры обоих типов характерно наличие четырех антипараллельных бета-стрендов (бета тип фолда, обнаруженный только у анемонотоксинов). Несмотря на явное подобие 3D-структур оба типа токсинов отличаются друг от друга по иммунологическим свойствам.
Высокогомологичные последовательности RTX-IV значительно отличаются от последовательностей анемонотоксинов 1 типа. В пределах одного типа наблюдается высокая степень структурной гомологии (до 98%), между полипептидами разных типов она не превышает 40%. Характерной особенностью токсинов 2 типа является отсутствие 1 остатка на N-конце последовательности и наличие 3-4 основных остатков на С-конце. В последовательностях 2 типа содержится гораздо больше заряженных и ароматических остатков. Несмотря на значительные различия, идентичное расположение S-S связей и наличие консервативных остатков у обоих типов позволяет предположить, что они имеют общий анцестральный ген и значительно дивергировали в ходе эволюции. Разделение длинных анемонотоксинов на два структурных типа не позволило объяснить различия в их фармакологических свойствах.
В лаборатории проведено первое систематическое исследование структурно-функциональных взаимоотношений нейротоксинов типа 2 на примере наиболее токсичного полипептида RTX-III с химически модифицированными аминогруп-пами заряженных остатков Lys и Arg, N-концевого Gly, модифицированными карбоксильными группами восьми остатков, включая С-концевой, модифицированными остатками Trp и сульфгидрильными группами после восстановления S-S связей. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод об отсутствии в последовательности RTX-III абсолютно важного для его функциональной активности остатка, что опровергло существовавшую концепцию «активного центра» (с остатком Arg13 в качестве центра связывания с Na+-каналом). Не считая эффекта от разрушения S-S связей максимальное падение активности (в 12 раз) происходило лишь в результате модификации N-концевой альфа-аминогруппы, в то время как модификация других остатков влияла на токсичность в значительно меньшей степени и не сопровождалась изменением конформации молекулы, как показал КД-спектроскопический анализ. Тем не менее, показано, что протонированные аминогруппы и карбоксильные группы некоторых остатков важны для проявления биологической активности токсина. Наличие эффекта от модификации заряженных остатков позволило сделать вывод, что взаимодействие RTX-III с Na+-каналом является, с одной стороны, электростатическим, а с другой  многоточечным, т.к. после блокирования одного-двух функционально важных остатков остальные, оставшиеся свободными, продолжают выполнять свою функциональную роль. В результате электрофизиологических исследований было показано, что RTX-III взаимодействует с участком наружной поверхности канала. Эта поверхность не принадлежит воротному устройству канала, которое находится во внутриклеточном сегменте и отвечает за инактивацию. Оказываемый эффект замедления кинетики инактивации канала осуществляется посредством аллостерических взаимодействий токсина с каналом с образованием стабилизирующих гидрофобных контактов, на что указывает наличие на поверхности молекулы RTX-III обширной гидрофобной области.

Из разных видов актиний (H. сrispa, Oulactis (Anthopleura) orientalis, Metridium senile, Cribrinopsis similis) выделены низкомолекулярные (5 и 6 кДа) и высокомолекулярные (20 кДа) цитолизины (актинопорины).
Изучены некоторые физико-химические характеристики и липидная специфичность актинопоринов. Установлены аминокислотные последовательности 5 актинопоринов.
Проведено исследование механизма действия актинопоринов на биологических и модельных мембранах (эритроцитах, яйцеклетках морского ежа, липосомах, бислойных липидных мембранах. Было показано, что формируемые ими в мембранах каналы потенциалзависимы и селективны для катионов. Также было установлено, что для необратимого связывания с мембраной помимо сфингомиелина необходим холестерин, т.к. именно эти два соединения образуют в биологических и модельных мембранах липидные микродомены (рафты), которые, очевидно, являются местом связывания актинопорина с мембраной. Данные первичной структуры, результаты рентгеноструктурного и электрономикроскопического анализа, а также биофизических и биохимичесческих исследований актинопринов позволили выяснить основные закономерности их взаимодействия с мембраной.
Проведен сравнительный структурно-функциональный анализ актинопоринов тропических и дальневосточный актиний, который позволил определить структурные особенности функционально значимого N-концевого фрагмента и фосфорилхолинового (POC) сайта связывания молекулы, важных для ее пороформирующей активности.
Установлено, что актинопорин RTX-A оказывает высокую канцерпревентивную активность по отношению к мышиным эпителиальным клеткам JB6P+Cl41, трансформированным в раковые. В результате исследования мебранотропного действия актинопоринов на биологических моделях, развивающихся эмбрионах и неоплодотворенных яйцеклетках морского ежа Strongylocentrotus intermedius, было установлено, что помимо белок-липидных взаимодействий актинопорины участвуют в белок-белковых, что может объяснять их фармакологическую активность по отношению к опухолевым, паразитарным и другим видам клеток-мишеней. Эти данные явились предпосылкой к дальнейшему исследованию актинопоринов и получению их рекомбинантных форм, а также к изучению взаимодействий актинопоринов с их возможными мембранными рецепторами, интегринами, на молекулярном уровне. Так, с использованием методов молекулярной биологии получен рекомбинантный актинопорин RTX-S3, обладающий гемолитической активностью, идентичной нативному актинопорину RTX-SII.
При помощи двух независимых методов: точечной фиксации потенциала на изолированном фрагменте эритроцита кролика, и метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии теней эритроцитов человека доказан общий для модельных и биологических мембран механизм литического действия цитолизинов актиний и связывание цитолизинов с белками цитоскелета эритроцитов. Установлено, что специфическое связывание цитолизина со сфингомиелином происходит за счет образования неполярных гидрофобных связей и приводит к последующему формированию в липидном матриксе пор диаметром 6-10 Ǻ. Разработан новый способ количественного определения сфингомиелина в биологических жидкостях, основанный на специфическом взаимодействии этого липида с цитолизинами актиний.

Из тропической актинии H. сrispa выделены и охарактеризованы четыре новых низкомолекулярных (6 кДа) ингибитора сериновых протеиназ, для которых определена полная или частичная аминокислотная последовательность, константы ингибирования, термодинамические, кинетические характеристики и специфичность взаимодействия с протеиназами. Показано, что два ингибитора сериновых протеиназ, RmIn-I и RmIn-II, помимо трипсинингибирующей, проявляют антигистаминную активность, причем эффект торможения развития аллергической реакции имеет дозозависимый характер. Из генетического материала актиний H. crispa методами молекулярной биологии получены 61 аминокислотная последовательность полипептидов, структурно гомологичных ингибиторам сериновых протеиназ семейства Кунитца. Высокая степень гомологии их аминокислотных последовательностей друг с другом и с уже известными ингибиторами позволила объединить их в комбинаторную библиотеку. Построены модели пространственных структур этих полипептидов, а также их комплексов с трипсином, химотрипсином, эластазой нейтрофилов человека. Рассчитаны важнейшие физико-химические характеристики полипептидов и определены функционально важные для связывания аминокислотные остатки. Установлено, что в зависимости от строения непосредственно взаимодействующего с ферментом полипептида, детали механизма взаимодействия с каноническим участком связывания трипсина могут различаться. Впервые показано, что полипептиды Кунитц-типа могут являться компетентными ингибиторами эластазы и, следовательно, обладать противовоспалительным действием.
Впервые из H. сrispa выделен также модулятор болевого ваниллоидного TRPV1 рецептора, проявляющий по отношению к этому рецептору пролонгированный ингибирующий эффект. Аминокислотная последовательность и пространственная структура этого ингибитора оказались высоко гомологичными со структурами ингибиторов сериновых протеиназ из данного вида и из других видов актиний. Анальгетическое действие ингибитора TRPV1 рецептора высокоспецифично, что связано с его высокой аффинностью к TRPV1, а высокая стабильность в организме обусловлена протеиназоингибирующей активностью. Впервые показано, что исследуемые ингибиторы актинии H. сrispa являются полифункциональными полипептидами. Построены структурные модели комплексов полипептидов комбинаторной библиотеки H. crispa с TRPV1 рецептором. Показано, что модулирующее действие полипептидов на функцию TRPV1 может быть обусловлено увеличением времени релаксации канала в связанном состоянии.

Из водных экстрактов актинии H. crispa выделен палитоксин, ранее обнаруженный только в зоонтариях, что косвенно подтверждает гипотезу о его синтезе симбионтными микроорганизмами.

Также из актинии O. orientalis в высокоочищенном состоянии выделены высокомолекулярные (14 кДа) ингибиторы сериновых протеиназ.

Определена тирозиназная активность ряда морских меланогенных микроорганизмов, симбионтных с морскими асцидиями, губками и двустворчатыми моллюсками. Из бактерий рода Pseudoalteromonas, синтезирующих меланоидные пигменты, выделены два фермента с различным уровнем удельной активности. Обнаружен штамм, продуцирующий L-ДОФА.

Сотрудниками лаборатории разработана стратегия создания перспективных ферментных лекарственных препаратов пролонгированного действия, основанная на фундаментальных закономерностях взаимодействия лекарственных препаратов с транспортным белком плазмы крови. Применение этой стратегии позволяет целенаправленно конструировать лекарственные препараты с заданными свойствами. Она включает использование безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ) в качестве носителя ферментов, теоретическое предсказание физико-химических и биологических свойств комплексов белка и фермента, получение и выделение конъюгатов фермента с альбумином.


Методы, которые мы используем

Одно из важнейших направлений деятельности лаборатории – изучение структуры и функций белков и пептидов, разработка нового поколения лекарственных препаратов пептидной природы и исследование молекулярных механизмов действия лекарств.
В процессе исследований для выделения, идентификации и изучения физико-химических характеристик и биологической активности полипептидов в лаборатории используются традиционные и современные методы выделительной белковой химии (различные виды колоночной хроматографии, FPLC и HPLC), физико-химические и биологические методы исследования (MALDI TOF MS спектроскопия, УФ-, КД- спектроскопия, биосенсорный анализ; биологические модели, такие как, яйцеклетки морского ежа, и различные культуры клеток, включая опухолевые). Для установления первичной структуры полипептидов используется сочетание ферментативных и химических методов деградации полипептидов с последующим автоматическим секвенированием полученных пептидов по методу Эдмана. Для установления структуры генов, кодирующих полипептиды, и получения рекомбинантных полипептидов в лаборатории широко применяются методы молекулярной биологии (клонирование, секвенирование и гетерологическая экспрессия). Для изучения вторичной структуры и факторов, влияющих на конформационное состояние полипептидов, используются методы оптической спектроскопии.
Для исследования молекулярных механизмов взаимодействия полипептидов с интересующими мишенями требуется в первую очередь знание пространственной структуры белков (как мишеней, так и действующего вещества). В отличие от молекулярно-биологических методов определения первичной структуры белка, которые широко применяются в лаборатории, эксперименты по определению пространственной структуры белковых молекул ещё не стали рутиной и требуют значительных сырьевых, финансовых и временных ресурсов. В тех случаях, когда экспериментально определить строение белков затруднительно, специалистами лаборатории проводится молекулярное моделирование пространственной структуры белка, исходя из гомологии первичных последовательностей с белками, 3D структура которых установлена экспериментально. Метод гомологичного моделирования пространственной структуры белка позволяет предсказать пространственную организацию и важнейшие физико-химические свойства исследуемого белка.
Межмолекулярное распознавание лежит в основе всех важнейших процессов в организме, например, белком-ферментом субстрата или лигандом белка-мишени. Методами компьютерного моделирования, а именно молекулярным докингом, проводится исследование взаимодействия лигандов с рецепторами. Результаты докинга позволяют генерировать вероятную структуру комплекса рецептор–лиганд. Проводимый сотрудниками лаборатории разносторонний анализ полученных структур дает возможность оценить энергию взаимодействия (в 78% случаев хорошо коррелирует со значениями энергии образования комплекса), определить движущие силы, лежащие в основе распознавания в данной системе лиганд-рецептор и выявить функционально значимые элементы структуры рецептора или лиганда, и тем самым установить их структурно-функциональные взаимосвязи.
Молекулярные расчеты проводятся как с помощью лицензированных пакетов программного обеспечения для молекулярного моделирования локально установленного на компьютерном оборудовании лаборатории, работающем под операционными системами Windows (MODELLER, APBS, MOLMOL, SEQMOL, AUTODOCK) и Linux (MOE, DS Visualizer, YASARA, FOLDX), так и с использованием удаленного доступа к международным вычислительным ресурсам.